【摘要】  目的 探讨苍白球微量注射5?羟色胺(5?HT)对帕金森病模型大鼠旋转行为的调节作用.方法 大鼠右侧内侧前脑束注射6?羟多巴胺(6?OHDA)以制备帕金森病大鼠模型,2周后大鼠损毁侧苍白球埋置套管,恢复3 d后苍白球微量注射5?HT,观察5?HT对帕金森病模型大鼠旋转行为的影响.结果 苍白球微量注射5?HT(0.1 mmol/L)不能使大鼠产生明显的旋转行为及姿势改变.腹腔注射阈下剂量左旋多巴(L?DOPA, 3 mg/kg),大鼠仅产生微弱的对侧自发性旋转行为,与5?HT组相比,差异无显著性(P>0.05).而苍白球微量注射5?HT联合腹腔注射L?DOPA则可以明显增加大鼠的对侧自发性旋转圈数,与5?HT组相比,差异有显著性(u=3.00,P<0.05);与阈下剂量L?DOPA组相比,差异亦有统计学意义(u=16.00,P<0.01). 结论 5?HT可能通过调节苍白球的兴奋性来增强L?DOPA的抗帕金森病效应.
　　【关键词】  帕金森病;苍白球;血清素;羟多巴胺;旋转行为;大鼠,Wistar
　　[ABSTRACT] Objective To investigate the effects of intra?pallidal microinjection of 5?hydroxytryptamine (5?HT) on rotational behavior in rats.  Methods A model of Parkinson disease was constructed by injecting 6?OHDA into the right medial forebrain bundle of rats. Two  weeks later, a guide cannula was implanted into the globus pallidus (GP) of the destructed side. After three?day's recovery, 5?HT was microinjected into GP and the effects on rotational behavior was observed.  Results Intra?pallidal injection of 5?HT (0.1 mmol/L) alone did not induce any rotational behavior or postural changes. Intraperitoneal injection of a subthreshold dose of 3,4?Dihydroxy?L?phenylalanine (L?DOPA, 3 mg/kg i.p.) could induce only a mild contralateral rotational behavior, compared with 5?HT, no significant difference was noted (P>0.05). Combined intra?pallidal injection of 5?HT and intra?peritoneal injection of L?DOPA dramatically increased the number of opposite?side spontaneous rotations (u=3.00,P<0.05 vs. 5?HT; u=16.00,P<0.01 vs. L?DOPA).  Conclusion Anti?Parkinson effects of L?DOPA probably through regulating the excitability of globus pallidus by 5?HT.
　　[KEY WORDS] Parkinson disease; Globus pallidus; Serotonin; Oxidopamine; Rotational behavior; Rats, Wistar
　　苍白球是基底神经节间接环路重要的中继核团,在机体运动功能调节中发挥重要作用.苍白球主要接受来自纹状体的γ?氨基丁酸(GABA)能抑制性纤维投射以及来自丘脑底核的谷氨酸能兴奋性突触传递.通过GABA能神经元广泛的纤维投射,苍白球可以支配基底神经节的各个核团.帕金森病是机体运动障碍性疾病.一系列的研究结果表明,苍白球与帕金森病的发病密切相关.在帕金森病病人及其动物模型,多巴胺能神经纤维支配的缺失,使苍白球兴奋性降低,输出减少,从而导致帕金森病运动减少等症状.近年来有研究结果显示,苍白球同步节律性放电直接导致帕金森病的静止性震颤症状,并且其电活动的改变程度与帕金森病震颤及运动减少等症状的严重性直接相关[1].大量研究表明,苍白球中的5?羟色胺(5?HT)在机体运动调节中发挥着重要作用.有研究报道,苍白球内含有较高水平的5?HT[2].解剖学研究提示,苍白球接受丰富的来自中缝背核的5?HT能神经纤维的支配.免疫组织化学和原位杂交等技术表明,苍白球表达多种5?HT受体亚型[3,4].电生理学研究还证实,5?HT可以调节苍白球神经元的兴奋性[5].为进一步探讨5?HT是否可以通过调节苍白球神经元的兴奋性,从而起到抗帕金森病的作用,本实验观察了在单侧6?羟多巴胺(6?OHDA)损毁的帕金森病模型大鼠苍白球内微量注射5?HT,对阈下剂量左旋多巴(L?DOPA)所诱发的大鼠对侧自发性旋转行为的影响.现将结果报告如下.
　　1       材料与方法
　　1.1       动物准备
　　选择健康成年雄性Wistar大鼠,体质量200~250 g,由青岛市药检所提供.大鼠均在室温(22±1)℃,昼夜循环光照的环境下饲养,自由进水和饮食.动物于实验前适应实验室环境1周.
　　1.2       药品及配制
　　6?OHDA、L?DOPA和苄丝肼购自美国Sigma公司,分别用1 g/L的抗坏血酸溶解.水合氯醛购自上海化学试剂公司,用无菌生理盐水配制.多聚甲醛购自上海试剂一厂,用0.1 mol/L的pH 7.4的 PBS配制.
　　1.3       实验方法
　　1.3.1       6?OHDA所致的帕金森病大鼠模型的制备80 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,俯卧位固定在脑立体定位仪上,充分暴露颅骨表面,使前后囟保持在同一水平面,用三棱针在颅骨表面内侧前脑束投射区域钻孔.参照Paxinos和Watson大鼠脑图谱,将4 μL 6?OHDA溶液(2 g/L)缓慢注射到右侧内侧前脑束,坐标为:前囟后3.2 mm,旁开1.5 mm,颅骨表面下8.4 mm.注射速度为1 μL/min,4 min注完,留针10 min,缓慢退针,最后缝合皮肤.术后第14 天,大鼠腹腔注射L?DOPA(50 mg/kg)和苄丝肼(30 mg/kg),观察大鼠对侧自发性旋转圈数(r),旋转圈数总数每2 h>200 r为合格帕金森病大鼠模型[6].
　　1.3.2       苍白球埋置套管       合格的帕金森病模型大鼠恢复1 d后,用80 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位固定在脑立体定位仪上,充分暴露颅骨表面,使前后囟保持在同一水平面,用三棱针在颅骨表面苍白球投射区域钻孔,参照大鼠脑图谱,将长12.0 mm、内径0.3 mm、外径0.4 mm的不锈钢套管垂直置入右侧苍白球上方,坐标为:前囟后1.0 mm,旁开3.0 mm,颅骨表面下3.4 mm.将一小螺丝钉固定于颅骨表面,用502胶和自凝造牙粉固定套管,并置入不锈钢内芯防止套管阻塞.
　　1.3.3       旋转行为测试       大鼠经过术后3 d恢复,进行旋转行为测试.将大鼠随机分为A、B、C共3组.A组(6只)腹腔注射苄丝肼(6 mg/kg)+1 g/L抗坏血酸,10 min后,苍白球微量注射1 μL 5?HT(0.1 mmol/L);B组(8只)腹腔注射苄丝肼(6 mg/kg)+ L?DOPA(3 mg/kg),10 min后,苍白球微量注射1 μL无菌生理盐水;C组(10只)腹腔注射苄丝肼(6 mg/kg)+ L?DOPA(3 mg/kg),10 min后,苍白球微量注射0.1 mmol/L  5?HT 1 μL.拔针后观察大鼠每10 min内对侧自发性旋转圈数,连续观察1 h.进行苍白球微量注射时,在大鼠清醒、自由活动的状态下,拔出内芯,将与1 μL微量注射器相连的注射针插入套管中.注射针头超过外套管边缘3.4 mm.以0.1 mmol/L的5?HT 1 μL或无菌生理盐水1 μL通过微量注射器缓慢均匀地分别注入到苍白球内,于2 min内注射完毕,注射完毕后留针1 min.
　　1.3.4       组织学检查       大鼠行为学实验结束后,经左心室相继灌注生理盐水200 mL、40 g/L多聚甲醛200 mL.大脑取出后冷冻30 min,用冰冻切片机将大脑切成50 μm 厚的脑片,在显微镜下观察针道的位置.只有针道位置正确的大鼠,其数据才被用于统计分析.
　　1.4       统计学分析
　　实验所得数据以±s表示.数据之间比较采用非参数ANOVA(Kruskal?Wallis)检验及Mann?Whitney U检验[7].
　　2       结果
　　帕金森病模型大鼠右侧苍白球内微量注射5?HT(0.1 mmol/L)不能引起明显的旋转行为以及姿势改变,1 h内旋转圈数为(2.67±2.47)r.腹腔注射L?DOPA(3 mg/kg)仅产生微弱的对侧自发性旋转行为,1 h内旋转圈数为(31.00±14.65)r.而大鼠腹腔注射L?DOPA(3 mg/kg)联合右侧苍白球微量注射0.1 mmol/L 5?HT可引起明显的对侧自发性旋转行为,1 h内旋转圈数为(189.00±58.64) r.C组中7只大鼠在注药后10 min内立即出现对侧旋转行为并达到高峰,旋转行为可以持续1 h以上;另外3只大鼠没有产生明显的对侧自发性旋转行为.3组大鼠旋转圈数比较差异有显著意义(H=10.23,P<0.01).C组与A组相比,大鼠对侧旋转圈数明显增加,差异有显著性(u=3.00,P<0.01),与B组相比旋转圈数有所增加,差异有显著性(u=16.00,P<0.05),A组与B组相比差异没有统计学意义(P>0.05).苍白球内微量注射5?HT或无菌生理盐水后10、20、30及40 min内,C组与A组和B组相比较,大鼠的对侧自发性旋转效应明显增强(H=9.70~12.45,u=0~18.50,P<0.05).见表1.表1  苍白球微量注射5?HT对帕金森病模型大鼠旋转行为的影响与A、B组相比,H=9.70~12.45,*u=0~18.50,P<0.05
　　3       讨 论
　　众所周知,基底神经节内主要存在两条通路,直接通路和间接通路.直接通路起源于纹状体的一群GABA能神经元,其抑制性纤维直接投射到基底神经节的输出核团,即苍白球内侧段和黑质网状带,解除了这些核团对丘脑和大脑皮质的抑制效应,从而易化运动.而间接通路是起源于纹状体的另一群GABA能神经元,其抑制性纤维投射先后经过苍白球外侧段GABA能纤维和丘脑底核谷氨酸能纤维的中继,而支配基底神经节的输出核团,增强这些核团对丘脑和大脑皮质的抑制效应,从而抑制运动.正常情况下,这两条通路的活动在大脑皮质和黑质致密带复杂的调控下处于平衡状态,共同使大脑皮质维持一定的兴奋性,从而保证机体具有正常的随意运动功能.一旦这种平衡状态被打破,就会导致多种运动障碍性疾病,如帕金森病[8].目前已经了解的帕金森病发病机制是黑质致密带多巴胺能神经元退行性变,导致间接通路纹状体投射神经元的过度活动,使苍白球外侧段的活动受到抑制,从而对丘脑底核的抑制解除,丘脑底核的过度活动促使苍白球内侧段和黑质网状带的抑制性输出增强,抑制大脑皮质的活动而引起运动功能减退.
　　L?DOPA是多巴胺的前体物质,能够通过血?脑脊液屏障进入脑内,被黑质神经细胞或其他神经细胞摄取,在多巴脱羧酶的作用下,脱去一个羧基,变成多巴胺,从而补充纹状体内多巴胺含量.在单侧6?OHDA帕金森病模型大鼠,由于损毁侧纹状体多巴胺受体敏感性增高,多巴胺与多巴胺受体结合,使同侧直接通路活动增加而间接通路活动降低,基底神经节输出核团的抑制性输出减少,增加了丘脑和大脑皮质的兴奋性,引起大鼠向对侧自发性旋转.本实验观察到给予低于阈值剂量的L?DOPA,仅能使大鼠产生微弱的对侧自发性旋转行为,其机制可能是:腹腔注射阈下剂量L?DOPA不能充分补充纹状体内多巴胺含量,仅能轻度增加同侧丘脑和大脑皮质的兴奋性,最终引起大鼠产生微弱的对侧旋转行为.
　　在本实验中,联合给予0.1 mmol/L 5?HT和L?DOPA(3 mg/kg)可以引起单侧6?OHDA帕金森病模型大鼠明显的对侧自发性旋转行为,揭示了苍白球微量注射5?HT可以增强阈下剂量L?DOPA的抗帕金森病效应.而单纯苍白球内微量注射5?HT并不能诱发大鼠的旋转行为,提示了5?HT增强阈下剂量L?DOPA的效应并不是两种作用的简单相加,而可能是5?HT通过复杂的受体机制调节苍白球的兴奋性来实现的.同时,本实验结果显示,苍白球内微量注射5?HT或无菌生理盐水后10、20、30及40 min内,C组与A组和B组相比,大鼠的对侧自发性旋转效应明显增强,说明5?HT增强阈下剂量L?DOPA的效应主要是在作用的早期.
　　大量研究表明,苍白球表达多种5?HT受体亚型[3,4].以往研究结果认为,苍白球缺乏5?HT1A受体的表达.也有部分研究结果显示,5?HT可以通过激活突触后膜5?HT1A受体抑制苍白球神经元的兴奋性,使其放电频率降低[9].5?HT1B受体主要作为异身受体存在于纹状体?苍白球GABA能投射纤维的末梢,激活5?HT1B受体,可以减少苍白球内GABA的释放,从而提高苍白球神经元的兴奋性[9].在体电生理学研究也证实,5?HT能兴奋大部分苍白球神经元.最近又有研究指出,5?HT还可以通过激活突触后5?HT2C、5?HT4和5?HT7受体兴奋苍白球神经元[10].由此推测,在整体情况下5?HT对苍白球神经元的兴奋作用占优势.5?HT可能是通过激活多种5?HT受体亚型来调节苍白球的兴奋性,使注射侧的苍白球兴奋性较对侧明显增强,从而抑制丘脑底核的过度活动,增强阈下剂量的L?DOPA所诱发的大鼠对侧自发性旋转行为.
　　本文结果还表明,腹腔注射阈下剂量L?DOPA所诱发大鼠旋转效应高峰出现在给药后30 min内,而联合苍白球注射5?HT后,旋转效应高峰立即出现,并呈递减趋势.该结果提示,苍白球微量注射5?HT后可以立即兴奋苍白球神经元,最终使损毁侧基底神经节的抑制性输出去抑制,从而增强丘脑和大脑皮质的兴奋性.本实验室前期研究结果揭示,5?HT可以引起氟哌啶醇导致的僵直大鼠的偏转行为,这种偏转行为在注射药物后立即出现并持续1 h以上.这与本实验结果是一致的.
　　综上所述,在6?OHDA所致的帕金森病模型大鼠损毁侧苍白球内微量注射5?HT,可以增强阈下剂量L?DOPA所诱发的大鼠对侧自发性旋转行为.5?HT的这种作用可能是通过激活苍白球的多种5?HT受体亚型从而调节苍白球的兴奋性来实现的.目前,多巴胺的前体L?DOPA仍然是治疗帕金森病的有效手段.然而,长期应用L?DOPA会导致一系列的副作用,如开关现象和剂量峰值异动症.鉴于苍白球在基底神经节环路中所起的重要作用,本实验为进一步深入探讨5?HT在帕金森病治疗中的意义提供了初步的理论和实验依据.
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