【摘要】  目的 观察密度梯度离心并贴壁培养法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的效果,以及诱导后的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离兔骨髓间充质干细胞.采用倒置显微镜进行形态学观察、免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原;经成骨培养液诱导培养后,对碱性磷酸酶活性、细胞矿化形成钙化结节的能力进行测定.结果 分离的骨髓间充质干细胞24 h后贴壁,贴壁细胞平均10 d形成克隆,细胞表型稳定.诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,Von.Kossa染色可见矿化结节.结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化兔骨髓间充质干细胞,用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性.
　　【关键词】  骨髓;间质干细胞;细胞培养技术;成骨分化;兔
　　[ABSTRACT] Objective To observe the effect of in-vitro isolation and  purification of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (rBMSCs) by density gradient centrifugation (DGC) and attachment culture, and the osteogenic characteristics of induced rBMSCs. Methods rBMSCs were isolated and purified. The growth of rBMSCs was observed inverted-microscopically. rBMSCs membrane antigens were identified by immunocytochemical technique. After the rBMSCs were cultured in the osteogenesis inducing medium, the activity of the alkaline phosphatase (ALP) and ability to form mineralized nodus were examined.Results The isolated rBMSCs began to adhere after cultured for 24 hours, the attached rBMSCs began to form clone at average of 10 days and the phenotype of rBMSCs was stabilized. The ALP activities were increased obviously under induction. Mineralized nodus could be seen with Von.Kossa staining. Conclusion DGC combined with attachment method can effectively isolate and purify rBMSCs. The cells cultured with this technique possess a general bionomics of BMSCs.
　　[KEY WORDS]Bone marrow; Mesenchymal stem cells; Cell culture technique; Osteogenic differentiation; Rabbit
　　骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有较强的增殖活性.研究表明,BMSCs 具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞等多种组织细胞分化的能力[1,2],因而其在组织工程、细胞工程领域潜在的应用价值越来越受到人们重视.本研究采用密度梯度离心法分离BMSCs,结合贴壁培养法进行培养,并用诱导分化培养液做定向诱导培养,观察BMSCs向成骨细胞分化过程中的细胞形态学变化,进行成骨细胞生物学表型鉴定,以探讨BMSCs的培养方法、生长规律及向成骨细胞分化的特性.
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  实验动物
　　2月龄新西兰纯种大耳白兔,由青岛市实验动物中心提供.
　　1.1.2 试剂
　　Percoll分离液(天津灏洋生物制品公司),DMEM培养基(Gibco公司)、胰酶(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物公司),地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸(Sigma公司),大鼠抗兔CD34-FITC、CD29-FITC(北京中山生物公司).
　　1.1.3 成骨诱导液
　　包含基础培养液(内含体积分数0.10 胎牛血清、 低糖DMEM、100 U/L 青霉素、100 U/L链霉素),10 mmol/L的β-甘油磷酸钠,10-7 mol/L 地塞米松,50 mg/L维生素C.
　　1.2 方法
　　1.2.1  BMSCs分离和培养
　　兔用30 g/L戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉,髂后上嵴处备皮.无菌术抽取肝素抗凝骨髓约5 mL,加入5 mL的L-DMEM培养液混匀,以1 000 r/min离心5 min,弃去上清液.
　　以5 mL L-DMEM培养液重悬细胞.将1.077 kg/L Percoll 分离液先置于试管的底部,然后按照1∶1 的比例缓慢滴加稀释后的骨髓,以2 500 r/min 离心30 min,收获界面层的单核细胞.将其重悬于含体积分数0.10胎牛血清的L-DMEM培养液中,接种于25 cm2培养瓶内,浓度1.0×108/L,置于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱内孵育,每2~3 d换1 次液.待细胞生长至瓶底90%汇合时,进行传代.然后取第3代细胞进行成骨诱导培养,实验组加入诱导分化培养液,对照组加入等量基础培养液,每3 d换液1 次.
　　1.2.2  细胞观察
　　倒置相差显微镜观察体外培养细胞的生长、增殖及细胞形态的变化情况.
　　1.2.3  BMSCs生长曲线绘制
　　取1、3、5、7代兔BMSCs,消化,加入L-DMEM完全培养液,接种于24孔培养板中,作相应标记(P1、P3、P5、P7).细胞计数,计算均值,连续9 d.Microsoft Excel XP软件绘制细胞生长曲线.
　　1.2.4  BMSCs表面抗原分析
　　第3代细胞消化、计数、离心,加入200 μL PBS制成细胞悬液.设置阴性对照,加入大鼠IgG1-FITC,其他管加入大鼠抗兔CD34-FITC、CD29-FITC,细胞与荧光素-共轭抗体抗CD29、CD34,在黑暗中孵化15 min.流式细胞仪检测.
　　1.2.5  碱性磷酸酶及矿化结节染色检查
　　成骨诱导14 d细胞爬片,在40 g/L多聚甲醛溶液中固定10~15 min后,用Gomori钙-钴法进行碱性磷酸酶染色检查[3].成骨诱导21 d细胞爬片后,行Von.Kossa染色检查.
　　2 结 果
　　2.1  细胞形态学观察
　　原代培养12 h后大部分细胞贴壁,细胞呈小多角形、梭形.9~10 d细胞互相融合达90%左右,此时细胞排列呈较均一的螺旋状或旋涡状(图1).传代细胞呈小多角形、长梭形,形态较原代细胞更均一,生长旺盛,增殖迅速,胞核明显,核仁清晰.培养6~7 d就可达90%融合.传至第6代细胞形态无明显变化.
　　2.2 BMSCs生长曲线
　　BMSCs生长曲线呈S形.传代1~2 d生长缓慢,3~6 d快速增殖,7 d后细胞数量稳定.随传代次数增加,BMSCs的增殖能力减弱.第3、5代增殖能力最强,第1代次之,而第7代较前几代明显减弱(图2).
　　2.3  BMSCs表面标志
　　BMSCs不表达造血标志CD34,强表达CD29,阳性率为99.5%,表明BMSCs是区别于兔骨髓中造血细胞的另一类细胞.
　　2.4 碱性磷酸酶染色
　　诱导第14天诱导细胞呈碱性磷酸酶染色阳性,细胞内出现大量棕黑色的颗粒(图3).对照组无棕黑色沉淀或结节出现.
　　2.5 细胞矿化作用的检测
　　实验组BMSCs融合后继续培养,形成细胞结节,中心出现基质沉积.Von.Kossa染色阳性(图4),黑色沉着物分布于细胞外基质中,呈网状,而对照组无阳性反应.
　　3 讨 论
　　BMSCs取材方便,可在体外大规模扩增而不丢失多向分化潜能.骨髓基质细胞在骨组织受创伤刺激和局部微环境因素的影响下能够进行增殖,并经骨原细胞、前成骨细胞最终分化为成骨细胞以参与组织更新和创伤修复等[4~7].所以它已成为目前组织工程研究中重要的种子细胞.
　　目前常用的BMSCs分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选法、免疫磁珠法、流式细胞仪分离法等[4~8].全骨髓贴壁筛选法,维持了原始的生活环境,有利于分化,但所得BMSCs纯度不高.密度梯度离心法根据骨髓细胞成分比密度的不同,利用淋巴细胞分离液提取单核细胞进行贴壁培养,得到的细胞纯度较后者高.本实验结合密度梯度离心法和贴壁筛选法[9],利用密度为1.077 kg/L的Percoll分离液,能有效去除绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板,获得纯度较高的单个核细胞.然后,利用BMSCs的贴壁性,逐渐弃掉未贴壁细胞,从而获得足量的BMSCs,所获细胞形态均一,增殖速度快,生长性状稳定.
　　由于BMSCs没有公认的独特抗原表型[10],因此本次实验选用CD29、CD34作为鉴定BMSCs的指标.CD29是介导干细胞与细胞外基质黏附的最主要的分子[11].BMSCs CD29的高表达为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境.CD34为造血干细胞特异标记.本实验中所分离培养的BMSCs广泛表达CD29,不表达CD34,可见所分离的细胞属于间充质细胞,表达一般BMSCs所具有的表面抗原,不属于造血系细胞,说明本实验中所分离培养的细胞是BMSCs.
　　MANIATOPOULOS 等[12]首次报道鼠骨髓基质细胞在体外培养能形成钙化的骨样组织.国内学者也研究证明,骨髓基质细胞体外培养具有成骨能力[13,14].在成骨分化过程中,核心结合因子al(Cbfal)为其特异的转录因子,它的基因结合位点位于骨钙素、骨桥接蛋白、骨唾液蛋白、Ⅰ型胶原等基因的启动子,通过调节生长因子或细胞外基质的基因表达而参与成骨细胞分化及骨发育的全过程[1,15].本实验用地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸联合诱导BMSCs后[7,9],诱导培养的细胞第8天即出现沉积,并形成明显的钙结节.本实验碱性磷酸酶染色、Von.Kossa染色证实所培养的细胞为成骨细胞,具有成骨细胞的形态特征及生物学特征.本实验结果印证了1.077 kg/L的Percoll 密度梯度分离法的可靠性,免疫细胞化学法检查显示分离培养的细胞纯度高,表型稳定,可为组织工程提供比较理想的种子细胞,可以极大地提高组织工程修复组织缺损的能力,在骨缺损、骨折不愈合等的治疗中有着广阔的应用前景.
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