苦豆子总碱缓释磁性颗粒的制备及其性能检测
　　[摘要] 目的:制备苦豆子总碱缓释磁性颗粒,并研究其性能.方法:采用L9(34)正交试验确定苦豆子总碱缓释磁性颗粒最佳制备工艺.以pH6.8的磷酸盐缓冲溶液为释放介质,考察其体外释放性能,并通过振动样品磁强计测定其磁性能.结果:
　　苦豆子总碱缓释磁性颗粒最佳制备工艺组成为A1B3C2D2,即苦豆子总碱质量为1.0g,壳聚糖浓度为2.5%,壳聚糖质量为3.0g,微晶纤维素质量为1.5 g,Fe3O4纳米粒质量为1.5 g.苦豆子总碱缓释磁性颗粒具有较好的缓释性能,其体外释药特征符合一级动力学方程,同时也具有明显的磁响应性.结论:苦豆子总碱缓释磁性颗粒处方合理、制备工艺可行,具有缓释特性和超顺磁性,适用于消化道靶向给药.
　　[关键词] 苦豆子总碱,缓释,磁性颗粒,制备,性能
　　苦豆子总碱(Sophora alopecuroides L.totalalkaloids,SATA),是苦豆子的干燥全草或种子提取而得的总生物碱,属喹诺里西啶类,味苦性寒,广泛分布于我国西北地区,具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡等药理活性,其中抗消化道肿瘤作用较为显著[1-2].目前,苦豆子总碱的药物剂型有片剂、注射液、泡腾栓和油搽剂等.由于该药生物半衰期短、消除快、无代谢饱和现象,导致其体内血药浓度低,生物利用度也低;其体内分布快且广,靶向性较差,而且给药次数频繁,患者依从性差[3-4].为此本文结合缓释和磁靶向给药机制将其制备为缓释磁性颗粒(sustained-release magnetic granules,SRMG),以期使药物定位于消化道肿瘤部位,缓慢释放,高浓度集中在靶部位发挥作用,降低药物不良反应,提高药物生物利用度,实现靶向定位治疗肿瘤的目的[5-6].
　　壳聚糖为甲壳素的脱乙酰化产物,由于具有良好的生物相容性、生物可降解性和成膜性等优良理化性能和生物特性,无毒,环境友好,已被广泛用于各类药物制剂的研究,为一极具应用价值的优良药用辅料或载体[7-8].基于此,本文以壳聚糖为缓释材料,Fe3O4纳米粒为磁响应性材料,通过苦豆子总碱缓释磁性颗粒(SATA-SRMG)的制备工艺及其相关性能的基础探索研究,旨在为治疗消化道肿瘤提供一种新的天然药物制剂.
　　1 材料
　　1.1 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);CQ50超声波清洗仪(上海超声波仪器厂);振动样品磁强计(美国Lake Shore,735VSM,Model 7304);RC-6型溶出度测试仪(天津市光学仪器厂).
　　1.2 试剂 苦豆子总碱(宁夏紫荆花药业股份有限公司,按干燥品计算,含苦豆子总碱以槐定碱计为95.3%,苦参碱质量分数10.01%,批号100817);微晶纤维素(德国JRS药用辅料公司);Fe3O4纳米粒(南京爱普瑞纳米材料有限公司,批号E08072009);壳聚糖(中国科学院兰州化学物理研究所,相对分子质量800 000,脱乙酰度87%);苦参碱对照品(中国食品药品检定研究院,批号200508);甲醇为色谱纯,水为纯化水,其他试剂均为分析纯.
　　2 方法与结果
　　2.1 SATA-SRMG制备 精密称取壳聚糖适量,溶于体积分数为1%的醋酸溶液中,得到一定浓度的壳聚糖醋酸溶液,备用;分别精密称取苦豆子总碱、微晶纤维素及Fe3O4纳米粒适量;取苦豆子总碱,加至一定体积的备用壳聚糖醋酸溶液中,搅匀;依次加入微晶纤维素和Fe3O4纳米粒,搅匀;过40目筛制粒,50℃烘干;再精密量取一定体积的备用壳聚糖醋酸溶液,在缓缓搅拌下,均匀喷洒到上述颗粒上,对颗粒进行包裹包衣处理,混匀,50℃烘干,如此重复6次,即得苦豆子总碱缓释磁性颗粒.
　　2.2 正交试验 以壳聚糖浓度(A)、壳聚糖质量(B)、微晶纤维素质量(C)和Fe3O4纳米粒质量(D)为主要考察因素.拟将本品制成12 h缓释磁性颗粒,据此,参考2010年版中国药典[9]及文献[10]设计理想状况下,药物在0.5 h释药15%及在12 h释药90%,以本品于0.5 h的累积释药百分率(Q1)和12 h的累积释药百分率(Q2)与理想值偏差之和,再乘以0.5等于Y 为考察指标,即Y=(|Q1-15%|+|Q2-90%|)×0.5.各因素设立3个水平,按正交表L9(34)进行正交试验,见表1.
　　2.3 溶出度试验 按照2010年版中国药典二部附录ⅩC溶出度测定法第一法(转篮法)规定依法测定溶出度.以pH6.8磷酸盐缓冲液300 mL为溶出介质,转速100 r·min-1,温度为(37±0.5)℃,分别于0.5 h和12 h精密量取溶出介质2 mL,同时补充等温等体积的新鲜介质2 mL,经0.22μm微孔滤膜滤过,取续滤液,按"2.5.1"项下的色谱条件测定苦参碱峰面积,以苦参碱(C15H24N2O)计,计算SA-TA-SRMG中苦豆子总碱的Q1和Q2,代入上述公式得到Y 值,结果见表2,方差分析结果见表3.
　　表2 正交试验结果Tab 2 The results of orthogonal design序号因 素A B C DQ1/%Q2/%Y 值/%1 1 1 1 1 74.12 99.87 34.4952 1 2 2 2 31.91 99.25 13.0803 1 3 3 3 34.21 99.42 14.3154 2 1 2 3 77.65 99.65 36.1505 2 2 3 2 57.98 99.75 26.3656 2 3 1 2 48.91 99.59 21.7507 3 1 3 2 65.38 99.85 30.1158 3 2 1 3 64.80 99.89 29.8459 3 3 2 1 35.93 99.33 15.130K1 20.630 33.587 28.697 25.330K2 28.088 23.097 21.453 21.648K3 25.030 17.065 23.598 26.770极差7.458 16.522 7.244 5.122表3 方差分析结果Tab 3 The results of variance analysis方差来源离差平方和自由度均方F 值P 值A 84.34 2.000 42.17 2.015 >0.05B 419.387 2.000 209.6935 10.019 >0.05C 83.06 2.000 41.53 1.984 >0.05D 41.86 2.000 20.93 1.000 >0.05注:F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00由表2、表3可知,各因素对检测指标的影响无显著性差异.直观分析各因素对检测指标的影响大小顺序为B>A>C>D,并可见A1< A3<A2,B3<B2<B1,C2<C3<C1,D2<D3<D1.综合考虑,因为K 值越小越接近理想状态,故分别选取四因素K 值最小的水平A1B3C2D2为最佳制备工艺条件,即苦豆子总碱质量为1.0g,壳聚糖浓度为2.5%,壳聚糖质量为3.0g,微晶纤维素质量为1.5 g,Fe3O4纳米粒质量为1.5 g.
　　因此得出苦豆子总碱缓释磁性颗粒的最佳制备工艺流程如下:按最佳处方依次称取苦豆子总碱1.0g、壳聚糖3.0g、微晶纤维素1.5 g和Fe3O4纳米粒1.5 g,精密称定;将壳聚糖溶于体积分数为1%的醋酸溶液120 mL中,得体积分数为2.5%的壳聚糖醋酸溶液;精密量取2.5%的壳聚糖醋酸溶液30mL,加入至苦豆子总碱中,搅匀;依次加入微晶纤维素和Fe3O4纳米粒,搅匀,过40目筛制粒,50℃烘干;再精密量取2.5%的壳聚糖醋酸溶液15 mL,在缓缓搅拌下,均匀喷洒到上述颗粒上,对颗粒进行包裹包衣处理,混匀,50℃烘干,如此重复6次,即得苦豆子总碱缓释磁性颗粒.
　　2.4 工艺验证试验 按上述最佳制备工艺参数及流程,分别制备5批苦豆子总碱缓释磁性颗粒,结果显示,所得5批苦豆子总碱缓释磁性颗粒均为棕褐色,形态规则,以苦参碱计,含苦豆子总碱为13.92%~14.87%,制备工艺稳定,重复性好.
　　2.5 HPLC法测苦参碱2.5.1 色谱条件 美国安捷伦公司ZORBAX EclipseXDB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:
　　甲醇-0.1%磷酸(三乙胺调pH 至6.8)(55∶45);柱温:30℃;流速:1.0mL·min-1;检测波长:220 nm;进样量:5μL.
　　2.5.2 对照品溶液制备 精密称取苦参碱对照品适量,置棕色量瓶中,加pH6.8磷酸盐缓冲液溶解,并加至刻度,摇匀,得质量浓度为0.110        2 mg·mL-1的苦参碱对照品储备液.
　　2.5.3 供试品溶液制备 取SATA-SRMG 适量研碎,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入定量的pH6.8磷酸盐缓冲液,密塞,摇匀,称定重量,超声30 min,放冷,再称定重量,加pH6.8磷酸盐缓冲液补足减失的重量,摇匀,静止10 min,过滤,精密量取续滤液1 mL,转移置5 mL棕色量瓶中,加pH6.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度,摇匀,过滤,经0.22μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液.
　　2.5.4 阴性供试品溶液制备 取按最佳处方比例及制备工艺制成不含苦豆子总碱的阴性供试品,按"2.5.3"项下方法制得阴性供试品溶液.
　　2.5.5 系统适用性试验 按"2.5.1"项下的色谱条件,精密量取苦参碱对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液5μL,注入液相色谱仪,记录色谱图.
　　结果显示,苦参碱对照品色谱峰的保留时间约为8.5min.苦参碱对照品溶液与供试品溶液在相同的保留时间处有吸收峰,供试品溶液中苦参碱峰与其他组分分离完全.阴性供试品溶液在相同的保留时间处无吸收峰,表明对检测无干扰(见图1).
　　2.5.6 线性关系考察 精密量取上述苦参碱对照品储备液0.35,0.7,1.2,2.5,3.4,4.9 mL分别置于5mL棕色量瓶中,加pH6.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度,配制成不同浓度的对照品溶液,按"2.5.1"项下的色谱条件测定,以峰面积积分值(A)对质量浓度(C,μg·mL-1)进行回归,回归方程为:A =4.079 4C-3.261 1(r=0.999 9),结果表明,苦参碱在浓度为7.714~107.996μg·mL-1范围内,峰面积积分值与浓度有良好的线性关系.
　　2.5.7 精密度试验 精密量取同一对照品溶液,按上述色谱条件连续进样6次,测定峰面积,结果RSD为0.35%,表明仪器精密度良好.
　　2.5.8 稳定性试验 取同一批供试品溶液于室温避光放置,分别于0,2,4,6,8,12 h,按"2.5.1"项下色谱条件依法测定峰面积,结果RSD为0.47%,表明供试品溶液中苦参碱在12 h内稳定.
　　2.5.9 重复性试验 取同一批(批号20110208)供试品6份,按"2.5.3"项下方法制成供试品溶液,按"2.5.1"项下色谱条件测定.结果RSD为0.37%,表明方法重复性良好.
　　2.5.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品(批号20110208)6份,按已知量的80%,100%,120%剂量分别精密加入相应的苦参碱对照品,混匀,按"2.5.3"项下方法制备供试品溶液,依上述方法测定峰面积,计算加样回收率,苦参碱的平均回收率为98.2%,RSD为0.91%(n=6).
　　2.5.11 供试品含量测定 精密称取按最佳处方制备的3批供试品,按"2.5.3"项下方法制备成供试品溶液,并按"2.5.1"项下色谱条件,分别精密量取5μL注入液相色谱仪,测定苦参碱峰面积,以苦参碱(C15H24N2O)计,计算供试品中的苦豆子总碱含量,结果见表4.
　　数粒,置于白纸上,观察其外观形态.SATA-SRMG呈黑褐色,外观形态较圆整,较规则,粒径为0.45 mm左右,见图2.
　　2.7 SATA-SRMG体外释放性能考察 称取SATA-SRMG适量,精密称定,按照2010年版中国药典二部附录ⅩD释放度测定法第二法方法2规定,依法测定累计释放度.以pH6.8磷酸盐缓冲溶液300 mL为释放介质,转速100 r·min-1,温度为(37±0.5)℃,分别于0.5,1.5,3,5,8,12 h精密量取释放介质2 mL,同时补充等温等体积的新鲜介质2mL,用0.22μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,照上述"2.5.1"项下的色谱条件测定苦参碱峰面积,以苦参碱(C15H24N2O)为计,计算SATA-SRMG中苦豆子总碱的体外释放量,见图3.由图可知,SATASRMG于0.5 h的累计释放率为29.90%,于12 h的累积释放率为97.32%.
　　说明SATA-SRMG的释药行为更符合一级方程学规律.
　　2.9 SATA-SRMG 的磁性能测定 分别称取Fe3O4纳米粒和SATA-SRMG适量,精密称定,室温条件下用振动样品磁强计测定Fe3O4纳米粒和SATA-SRMG的磁性,记录数据,计算结果,得到Fe3O4纳米粒和SATA-SRMG 的磁化曲线,见图4.
　　从图4磁化曲线可知,纯Fe3O4纳米粒的饱和磁化强度为58.57 emu·g-1,而缓释磁球的饱和磁化强度约为9.85 emu·g-1,剩磁和矫顽力几乎为零.超顺磁性对于在生物医学和生物工程应用的聚合物磁球来说至关重要,该性质可使聚合物磁球不会产生聚集,而在磁场消失后能快速的重新分散[11].SATA-SRMG中含有Fe3O4纳米粒,表  现出超顺磁性,即具有良好的磁响应性,在外加磁场的引导下,可靶向定位于病灶局部,提高局部药物浓度,发挥良好的靶向释放作用.
　　图4 苦豆子总碱缓释磁性颗粒磁化曲线-○-苦豆子总碱缓释磁性颗粒;纯Fe3O4纳米粒Fig 4 Magnetization curve-○-SATA-SRMG;-pure Fe3O4nanoparticle3 讨论采用正交试验设计方法,优化工艺制得的SATA-SRMG呈黑褐色,外观形态较圆整,较规则.实验利用壳聚糖在酸性介质中溶胀形成胶体黏稠物质而阻滞药物扩散及溶出的性质,以及Fe3O4纳米粒的超顺磁响应特性制备成苦豆子总碱缓释磁性颗粒.该磁性颗粒表现出典型的超顺磁性及缓释释药特性行为,可望实现磁靶向定位于消化道肿瘤部位,口服后可迅速地达到治疗浓度,药物缓释特性可用于维持治疗药物浓度,有利于临床治疗,减少药物不良反应,提高药物生物利用度.因此,苦豆子总碱缓释磁性颗粒可望作为消化道肿瘤靶向给药新制剂,值得进一步研究.